Enews223 多色流式細胞技術的進階應用

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圖一:小鼠肺沖洗液之發炎細胞鑑定。小鼠誘導肺部發炎後,將肺沖洗細胞與帶有
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圖二:不同細胞族群對IL-2的訊息傳導比較。人類周邊血球與不同濃度之IL-2培養
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在2013年5月31日 (五) 10:41所做的修訂版本

高雄醫學大學e快報 第223期  研究資源整合發展中心專題


多色流式細胞技術的進階應用

研究資源整合發展中心 孫昭玲組長


本校研資中心自96年度購入多色流式細胞儀後,自此本校生醫研究進入多「彩」多姿的世界,由於多色流式細胞技術廣泛應用於細胞生物學與醫學之研究,本人藉此機會介紹三種進階應用,給高醫研究人員參考,希冀能提升高醫之研究能量。

簡單而言,流式細胞技術是利用雷射光激發螢光物質做為偵測細胞狀態的原理,再同時搭配多種單株抗體(各自結合不同螢光物質)的使用,即可利用顏色分析細胞種類、功能或狀態;詳細原理請參考免疫學方法類的書籍,在此並不贅述,但特別說明在做這類實驗時要考慮的因素:(1)所分析的檢體必定要是單一細胞,這是因為「流式」細胞技術是利用流體力學方式,讓單顆細胞一顆一顆流經雷射光前方,每顆細胞經過雷射光之照射,所得到的光子訊號(包含這顆細胞上的抗體所發射的螢光),會被快速與精準的記錄下來,以利之後的電腦分析,因此多顆細胞黏附在一起、死細胞、緩衝液中的雜質…等,皆會影響實驗數據;(2)抗體必須選擇特異性高的抗體,因此多為單株抗體,而能夠做Western blotting或是組織染色的抗體,並不一定適合用於流式細胞技術,選擇抗體時需多加注意;(3)選擇螢光物質時,需注意流式細胞儀的雷射配備,以研資中心的多色流式細胞儀為例,所選擇螢光物質必須要能被藍光(488 nm)、紅光(633 nm)或紫光(405 nm)激發(excitation),而且其所釋放出(emission)的光波,則必須要有相對應的光子偵測器可以接收,研資中心的多色流式細胞儀就是因為有12個光子偵測器,因此最多可以同時偵測12個顏色的螢光;(4)選擇螢光染劑時要注意彼此之間釋放出的光譜不要重疊太大,以免干擾太多導致儀器無法校正。

由於可以同時分析12個參數,多色流式細胞技術的應用很多,簡單介紹其中三種應用如下:

  1. 可應用於免疫學領域的細胞族群與功能分析;就如圖一所示,小鼠氣喘模式中,利用肺沖洗取得浸潤的白血球,由於所得細胞數很少,所以利用五種螢光抗體與細胞大小的參數(FSC),同時將白血球的五種細胞族群比例分析出來,這種方法也可用於血液腫瘤分型、幹細胞比例分析或是幹細胞標記分子的尋找。
  2. 多色流式細胞技術可應用於細胞訊息傳遞的分析;如圖二所示,利用5種抗體與細胞大小參數,則可瞭解同種刺激(在此例為不同濃度之IL-2)所傳遞之訊息(磷酸化的Stat5), 在不同族群的細胞(CD8 T細胞與三種次族群CD4 T細胞)中有何不同,這個方法也可以應用在同種細胞株,但同時觀察不同的訊息傳導分子,本中心的儀器可以最多可同時分析12種訊息分子,比起傳統Western blotting方法,流式細胞技術除了大大節省了細胞數目及實驗時間,而且還得到單顆細胞的訊號,而非所有細胞的蛋白質總合的結果。
  3. 多色流式細胞技術亦可應用於同時多種細胞激素濃度之測定,其原理類似enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),但是是將一級抗體結合在具有螢光之合成微珠上(如圖三A與B所示),而不同色階的微珠則結合不同細胞激素的抗體,如果檢體中有這些細胞激素的存在,則此群微珠又會帶有另一個顏色的螢光(例如:IL-8,圖C),根據標準品的濃度可以畫出螢光強度之標準曲線(圖D),如此即可推算檢體中細胞激素的含量,這種方法除了可以節省實驗時間,也可大幅節省檢體的體積,非常適合難得或少量的臨床檢體之研究。

透過以上的簡單說明,希望能幫助高醫研究人員,在生醫領域可以更上層樓,研資中心也會透過定期的教育推廣、委託上機與諮詢,以期提供更全面的研究服務。


Image:enews223研究資源整合發展中心-2.jpg

圖一:小鼠肺沖洗液之發炎細胞鑑定。小鼠誘導肺部發炎後,將肺沖洗細胞與帶有

     螢光之抗體染色,並利用LSR II上機分析。

(A)、點狀分析圖,x軸為細胞大小(FSC),y軸為淋巴球標記(APC-anti-CD3及

      APC-anti-B220)。

(B)、圈選圖A之淋巴球,再根據MHC class II區分T細胞與B細胞。 (C)、圈選圖A之非淋巴小細胞,利用CCR3區分嗜酸性白血球與嗜中性白血球。 (D)、圈選圖A之大細胞,利用CD11c與MHC class II區分樹突細胞與巨噬細胞。

     (分析圖由孫昭玲提供)



Image:enews223研究資源整合發展中心-3.jpg

圖二:不同細胞族群對IL-2的訊息傳導比較。人類周邊血球與不同濃度之IL-2培養

     後15分鐘,收取細胞染不同螢光抗體結合之抗CD127、抗CD4、抗CD8、
     抗CD25及抗磷酸化Stat5抗體,以流式細胞儀分析。
     (http://www.bdbiosciences.com/research/ics/sampledata/index.jsp; Permission from 
     BD Taiwan Company)


Image:enews223研究資源整合發展中心-4.jpg


圖三:流式細胞激素同時偵測多種細胞激素。同一顏色但色階不同之微珠,分別結合不同抗

     細胞激素之抗體後,以直方圖呈現(A)或點狀圖呈現(B),點狀圖x軸為二級螢光
     抗體之顏色訊號,(C)檢體中有一定量之IL-8存在,則點狀圖之IL-8色階會向右移
     動,根據其x軸所示之螢光強度,可利用標準曲線(螢光強度vs.細胞激素濃度)換算
     出IL-8的檢體濃度。
     (http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/manuals/live/web_enabled/01-
       81014-551811-E.pdf;Permission from BD Taiwan Company)


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