Enews223 多色流式細胞技術的進階應用
出自KMU e-News
高雄醫學大學e快報 第223期 研究資源整合發展中心專題
多色流式細胞技術的進階應用
研究資源整合發展中心 孫昭玲組長
本校研資中心自96年度購入多色流式細胞儀後，自此本校生醫研究進入多「彩」多姿的世界，由於多色流式細胞技術廣泛應用於細胞生物學與醫學之研究，本人藉此機會介紹三種進階應用，給高醫研究人員參考，希冀能提升高醫之研究能量。
簡單而言，流式細胞技術是利用雷射光激發螢光物質做為偵測細胞狀態的原理，再同時搭配多種單株抗體（各自結合不同螢光物質）的使用，即可利用顏色分析細胞種類、功能或狀態；詳細原理請參考免疫學方法類的書籍，在此並不贅述，但特別說明在做這類實驗時要考慮的因素：（1）所分析的檢體必定要是單一細胞，這是因為「流式」細胞技術是利用流體力學方式，讓單顆細胞一顆一顆流經雷射光前方，每顆細胞經過雷射光之照射，所得到的光子訊號（包含這顆細胞上的抗體所發射的螢光），會被快速與精準的記錄下來，以利之後的電腦分析，因此多顆細胞黏附在一起、死細胞、緩衝液中的雜質…等，皆會影響實驗數據；（2）抗體必須選擇特異性高的抗體，因此多為單株抗體，而能夠做Western blotting或是組織染色的抗體，並不一定適合用於流式細胞技術，選擇抗體時需多加注意；（3）選擇螢光物質時，需注意流式細胞儀的雷射配備，以研資中心的多色流式細胞儀為例，所選擇螢光物質必須要能被藍光（488 nm）、紅光（633 nm）或紫光（405 nm）激發（excitation），而且其所釋放出（emission）的光波，則必須要有相對應的光子偵測器可以接收，研資中心的多色流式細胞儀就是因為有12個光子偵測器，因此最多可以同時偵測12個顏色的螢光；（4）選擇螢光染劑時要注意彼此之間釋放出的光譜不要重疊太大，以免干擾太多導致儀器無法校正。
由於可以同時分析12個參數，多色流式細胞技術的應用很多，簡單介紹其中三種應用如下：
- 可應用於免疫學領域的細胞族群與功能分析；就如圖一所示，小鼠氣喘模式中，利用肺沖洗取得浸潤的白血球，由於所得細胞數很少，所以利用五種螢光抗體與細胞大小的參數（FSC），同時將白血球的五種細胞族群比例分析出來，這種方法也可用於血液腫瘤分型、幹細胞比例分析或是幹細胞標記分子的尋找。
- 多色流式細胞技術可應用於細胞訊息傳遞的分析；如圖二所示，利用5種抗體與細胞大小參數，則可瞭解同種刺激（在此例為不同濃度之IL-2）所傳遞之訊息（磷酸化的Stat5）， 在不同族群的細胞（CD8 T細胞與三種次族群CD4 T細胞）中有何不同，這個方法也可以應用在同種細胞株，但同時觀察不同的訊息傳導分子，本中心的儀器可以最多可同時分析12種訊息分子，比起傳統Western blotting方法，流式細胞技術除了大大節省了細胞數目及實驗時間，而且還得到單顆細胞的訊號，而非所有細胞的蛋白質總合的結果。
- 多色流式細胞技術亦可應用於同時多種細胞激素濃度之測定，其原理類似enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA），但是是將一級抗體結合在具有螢光之合成微珠上（如圖三A與B所示），而不同色階的微珠則結合不同細胞激素的抗體，如果檢體中有這些細胞激素的存在，則此群微珠又會帶有另一個顏色的螢光（例如：IL-8，圖C），根據標準品的濃度可以畫出螢光強度之標準曲線（圖D），如此即可推算檢體中細胞激素的含量，這種方法除了可以節省實驗時間，也可大幅節省檢體的體積，非常適合難得或少量的臨床檢體之研究。
透過以上的簡單說明，希望能幫助高醫研究人員，在生醫領域可以更上層樓，研資中心也會透過定期的教育推廣、委託上機與諮詢，以期提供更全面的研究服務。
圖一：小鼠肺沖洗液之發炎細胞鑑定。小鼠誘導肺部發炎後，將肺沖洗細胞與帶有螢光之抗體染色，並利用LSR II上機分析。
- 點狀分析圖，x軸為細胞大小（FSC），y軸為淋巴球標記（APC-anti-CD3及APC-anti-B220）。
- 圈選圖A之淋巴球，再根據MHC class II區分T細胞與B細胞。
- 圈選圖A之非淋巴小細胞，利用CCR3區分嗜酸性白血球與嗜中性白血球。
- 圈選圖A之大細胞，利用CD11c與MHC class II區分樹突細胞與巨噬細胞。（分析圖由孫昭玲提供）
圖二：不同細胞族群對IL-2的訊息傳導比較。人類周邊血球與不同濃度之IL-2培養後15分鐘，收取細胞染不同螢光抗體結合之抗CD127、抗CD4、抗CD8、抗CD25及抗磷酸化Stat5抗體，以流式細胞儀分析。(http://www.bdbiosciences.com/research/ics/sampledata/index.jsp; Permission from BD Taiwan Company)
圖三：流式細胞激素同時偵測多種細胞激素。同一顏色但色階不同之微珠，分別結合不同抗細胞激素之抗體後，以直方圖呈現（A）或點狀圖呈現（B），點狀圖x軸為二級螢光抗體之顏色訊號，（C）檢體中有一定量之IL-8存在，則點狀圖之IL-8色階會向右移動，根據其x軸所示之螢光強度，可利用標準曲線（螢光強度vs.細胞激素濃度）換算出IL-8的檢體濃度。（http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/manuals/live/web_enabled/01-81014-551811-E.pdf；Permission from BD Taiwan Company）
