Enews267 自由基氧化搭配質譜儀應用於代謝物偵測的方法
出自KMU e-News
高雄醫學大學e快報 第267期 研究資源整合發展中心專題
自由基氧化搭配質譜儀應用於代謝物偵測的方法
研究資源整合發展中心 發展企畫組 梁世欣組長
目前尋找代謝物的分析模式可以初步分為兩類，第一類是生化方法；第二類為化學方法。生化方法是利用肝臟內的酵素與預期藥物進行作用後分析，所取的肝臟來源可分為兩種，第一種是鼠肝。方式應用如下。將老鼠犧牲，取其肝臟磨碎並與預期實驗藥物混合，反應一段時間後過濾、離心，取上清液入液相層析質譜儀分析。其作用機制是利用鼠肝的Cytochrome P450 (CYP450)酵素模擬人肝中的酵素與藥物化合，產生新的代謝產物供偵測。但是此方法有一些缺點，例如：需犧牲活體，較為耗時費工，鼠肝內的酵素仍與人類不同，反應時間的設定，鼠肝的品質等等。而第二種方式即是利用人體捐肝的方式進行相同的實驗(Human liver microsome, HLM)。
第二種模擬代謝物生成的方式則是利用化學的氧化還原方法。化學法亦可分為兩種，分別為電化學及化學試劑氧化法。電化學的方式是利用循環伏安法來進行，其方式是利用電極在緩衝溶液中對待測藥物通給固定的電壓或電流，不同的電壓與電流將導致產生不同的氧化或還原的代謝物，而設定條件可以是氧化電位亦或還原電位。經一段反應時間之後，將緩衝液(去鹽濃縮亦可)導入偵測儀器分離並偵測。但是，電化學方式仍有某些缺點，電極可能有過電壓，反應過程中電極表面可能進行電鍍而上了一層薄膜，過程中的薄膜產生將導致電壓與電流的不固定。循環伏安法無法直接與偵測器串接，所以通常進行的方式都是off-line的方式進行，不能直接線上分析，最後則是反應時間不同可能導致不同的代謝產物。
近年來，為了改善上述樣品前處理複雜及不能線上分析的困難，荷蘭廠商Antec利用循環伏安法的電極氧化還原模式，開發出線上分析的方法並串接至串聯式質譜儀進行偵測。Antec與Karst團隊合作，發表了非常多的相關文獻。其利用的範圍很廣很多，例如：肌肉鬆持劑「tetrazepam」的代謝模擬並與in vivo和in vitro的方法比較。其方式是利用注射針推動樣品入電極反應槽(flow cell)反應，一段時間後再緩推至三向閥(Valve)，藉由三向閥的轉換，讓HPLC推動動相讓反應樣品入管柱分離，最後藉由質譜偵測完成線上分析的理想，而其電極反應槽所使用的電極為石墨(碳)電極。利用三向閥的方式主因為電極反應槽並不耐高壓，所以與HPLC無法直接串連。其他應用尚有：生物小分子含氮鹼基的氧化代謝物，此實驗是利用鑽石電極進行(Magic Diamond electrode)。Antec的機器減少了樣品前處理所需耗費的人力與時間；亦與質譜儀器串聯，實現了線上分析的想法。但是，仍有不少缺點待克服。第一，仍然使用電極，電極的使用仍然無法避免過電壓與失活的可能。第二，不同的電極(例如石墨電極或不同金屬電極)可能在相同電壓及電流下有不同的效果，電極的使用成為第二個變因。第三，flow cell的耐壓為40 psi，無法直接分離設備串接使用，必需透過三向閥或是用於In fusion分析。
圖一、自由基氧化產生代謝產物的示意圖
因此，若利用氧化劑，在反應瓶中造成一個氧化的環境，將預期藥物氧化後直接由自動進樣器吸取樣品打入質譜儀中分析，流程圖如圖一所示。此優點免除電極氧化造成過電壓、電極失活的問題，又可直接上樣分析(on line)。隨著時間的變化，自動進樣器吸取不同時間的樣品進入質譜儀分析，又可以持續不斷的偵測代謝物的生成。以白藜蘆醇為例，其代謝物，包含：dihydroresveratrol, 3,4′-dihydroxy-trans-stilbene, lunularin, resveratrol monosulfate及 dihydroresveratrol monosulfate都可以被模擬出，藉由自動進樣器序列吸取樣品進行分析，依不同代謝物的含量，可以繪製出可能的生成途徑，如圖二。因此，利用氧化劑直接進行代謝物模擬的方法，將可開創出有別於傳統生物化學或是電化學的第三種代謝物生成、模擬暨偵測的新方式。
圖二、模擬白藜蘆醇與其代謝產物dihydroresveratrol, 3,4′-dihydroxy-trans-stilbene, lunularin, resveratrol monosulfate及dihydroresveratrol monosulfate的生合成
