Enews267 自由基氧化搭配質譜儀應用於代謝物偵測的方法

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高雄醫學大學e快報 第267期  研究資源整合發展中心專題



自由基氧化搭配質譜儀應用於代謝物偵測的方法

研究資源整合發展中心 發展企畫組 梁世欣組長


目前尋找代謝物的分析模式可以初步分為兩類,第一類是生化方法;第二類為化學方法。生化方法是利用肝臟內的酵素與預期藥物進行作用後分析,所取的肝臟來源可分為兩種,第一種是鼠肝。方式應用如下。將老鼠犧牲,取其肝臟磨碎並與預期實驗藥物混合,反應一段時間後過濾、離心,取上清液入液相層析質譜儀分析。其作用機制是利用鼠肝的Cytochrome P450 (CYP450)酵素模擬人肝中的酵素與藥物化合,產生新的代謝產物供偵測。但是此方法有一些缺點,例如:需犧牲活體,較為耗時費工,鼠肝內的酵素仍與人類不同,反應時間的設定,鼠肝的品質等等。而第二種方式即是利用人體捐肝的方式進行相同的實驗(Human liver microsome, HLM)。


第二種模擬代謝物生成的方式則是利用化學的氧化還原方法。化學法亦可分為兩種,分別為電化學及化學試劑氧化法。電化學的方式是利用循環伏安法來進行,其方式是利用電極在緩衝溶液中對待測藥物通給固定的電壓或電流,不同的電壓與電流將導致產生不同的氧化或還原的代謝物,而設定條件可以是氧化電位亦或還原電位。經一段反應時間之後,將緩衝液(去鹽濃縮亦可)導入偵測儀器分離並偵測。但是,電化學方式仍有某些缺點,電極可能有過電壓,反應過程中電極表面可能進行電鍍而上了一層薄膜,過程中的薄膜產生將導致電壓與電流的不固定。循環伏安法無法直接與偵測器串接,所以通常進行的方式都是off-line的方式進行,不能直接線上分析,最後則是反應時間不同可能導致不同的代謝產物。


近年來,為了改善上述樣品前處理複雜及不能線上分析的困難,荷蘭廠商Antec利用循環伏安法的電極氧化還原模式,開發出線上分析的方法並串接至串聯式質譜儀進行偵測。Antec與Karst團隊合作,發表了非常多的相關文獻。其利用的範圍很廣很多,例如:肌肉鬆持劑「tetrazepam」的代謝模擬並與in vivo和in vitro的方法比較。其方式是利用注射針推動樣品入電極反應槽(flow cell)反應,一段時間後再緩推至三向閥(Valve),藉由三向閥的轉換,讓HPLC推動動相讓反應樣品入管柱分離,最後藉由質譜偵測完成線上分析的理想,而其電極反應槽所使用的電極為石墨(碳)電極。利用三向閥的方式主因為電極反應槽並不耐高壓,所以與HPLC無法直接串連。其他應用尚有:生物小分子含氮鹼基的氧化代謝物,此實驗是利用鑽石電極進行(Magic Diamond electrode)。Antec的機器減少了樣品前處理所需耗費的人力與時間;亦與質譜儀器串聯,實現了線上分析的想法。但是,仍有不少缺點待克服。第一,仍然使用電極,電極的使用仍然無法避免過電壓與失活的可能。第二,不同的電極(例如石墨電極或不同金屬電極)可能在相同電壓及電流下有不同的效果,電極的使用成為第二個變因。第三,flow cell的耐壓為40 psi,無法直接分離設備串接使用,必需透過三向閥或是用於In fusion分析。





圖一、自由基氧化產生代謝產物的示意圖


因此,若利用氧化劑,在反應瓶中造成一個氧化的環境,將預期藥物氧化後直接由自動進樣器吸取樣品打入質譜儀中分析,流程圖如圖一所示。此優點免除電極氧化造成過電壓、電極失活的問題,又可直接上樣分析(on line)。隨著時間的變化,自動進樣器吸取不同時間的樣品進入質譜儀分析,又可以持續不斷的偵測代謝物的生成。以白藜蘆醇為例,其代謝物,包含:dihydroresveratrol, 3,4′-dihydroxy-trans-stilbene, lunularin, resveratrol monosulfate及 dihydroresveratrol monosulfate都可以被模擬出,藉由自動進樣器序列吸取樣品進行分析,依不同代謝物的含量,可以繪製出可能的生成途徑,如圖二。因此,利用氧化劑直接進行代謝物模擬的方法,將可開創出有別於傳統生物化學或是電化學的第三種代謝物生成、模擬暨偵測的新方式。








圖二、模擬白藜蘆醇與其代謝產物dihydroresveratrol, 3,4′-dihydroxy-trans-stilbene, lunularin, resveratrol monosulfate及dihydroresveratrol monosulfate的生合成



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