Enews245 多色流式細胞技術的進階應用-II
出自KMU e-News
高雄醫學大學e快報 第245期 研究資源整合發展中心專題
多色流式細胞技術的進階應用-II
研究資源整合發展中心 孫昭玲組長
本校研資中心自96年度購入多色流式細胞儀後，自此本校生醫研究進入多「彩」多姿的世界，多色流式細胞技術廣泛應用於細胞生物學與醫學領域之研究，本人已於上次e快報中介紹三種進階應用，這次將介紹另外流式細胞技術需要注意的實驗技巧，給高醫研究人員參考，希冀能提升高醫之研究能量。
本校多色流式細胞儀配備有三支雷射光，分別是藍光（488 nm laser）、紅光（633 nm）、及紫光（405 nm）雷射，其中藍光雷射激發後可以收集六個波段的可見光，紅光與紫光雷射激發後，分別各收集三個波段的光譜，因此共可偵測十二個顏色的光譜。
一、螢光物質的選擇
選擇螢光物質時，只要注意該螢光物質，是否能被其中一種雷射激發，激發後發射出的光譜是否位在偵測器範圍內，就可以判斷可否使用該螢光物質作實驗了， 為了方便使用者，研資中心已將十二個偵測器與其能夠使用的螢光物質列表（表一），以利使用者設計實驗，例如：APC螢光是由633nm雷射激發，其偵測器編號D，會收集660±20 nm的光波，因此APC可以用於本校的LSRII。這些相關訊息皆放在網站上[1]。另外，多種螢光抗體一起使用時，也需要注意光譜重疊的情形，如圖一，例如PE-Cy5與PerCP的放射光譜重疊部分太多 不宜一起使用，反之，PE-Cy5與PE-Cy7可以一起搭配使用。
二、抗體與螢光物質的搭配
確定好螢光染劑後，還須搭配正確的單株抗體，才能實驗成功，主要的搭配原則是：螢光亮的染劑，搭配表現量低的分子（單株抗體），而螢光暗的染劑，搭配表現量高的分子；另外，如果要偵測的分子位於細胞內，則螢光染劑選擇亮的實驗效果較好。目前常用較亮的螢光染劑是PE與APC，而FITC染劑雖沒有前二者來得亮，但不易與其它染劑有顏色上的干擾，因此也常運用於實驗上。
三、去除死細胞的干擾
對於比例低的（<10%）的陽性細胞（被螢光抗體染上的細胞），需要去除死細胞的干擾，所得比例才會精準，因為死細胞通常會與單株抗體做非特異性結合（如圖二A紅色圈選處），造成偽陽性的訊號，因此可以利用與死細胞結合的染劑，例如：PI或是7-AAD，先將死細胞圈選除外後，再分析螢光抗體陽性的細胞比例（如圖二B），數值才會正確；其中選擇7-AAD比選擇PI為佳，因為PI的放射光譜範圍廣，比較容易干擾到別的顏色，例如：PI會干擾PE的顏色，因此二者不能共用。
