Enews245 多色流式細胞技術的進階應用-II

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高雄醫學大學e快報 第245期  研究資源整合發展中心專題


多色流式細胞技術的進階應用-II

研究資源整合發展中心 孫昭玲組長


本校研資中心自96年度購入多色流式細胞儀後,自此本校生醫研究進入多「彩」多姿的世界,多色流式細胞技術廣泛應用於細胞生物學與醫學領域之研究,本人已於上次e快報中介紹三種進階應用,這次將介紹另外流式細胞技術需要注意的實驗技巧,給高醫研究人員參考,希冀能提升高醫之研究能量。 本校多色流式細胞儀配備有三支雷射光,分別是藍光(488 nm laser)、紅光(633 nm)、及紫光(405 nm)雷射,其中藍光雷射激發後可以收集六個波段的可見光,紅光與紫光雷射激發後,分別各收集三個波段的光譜,因此共可偵測十二個顏色的光譜。


一、螢光物質的選擇

選擇螢光物質時,只要注意該螢光物質,是否能被其中一種雷射激發,激發後發射出的光譜是否位在偵測器範圍內,就可以判斷可否使用該螢光物質作實驗了, 為了方便使用者,研資中心已將十二個偵測器與其能夠使用的螢光物質列表(表一),以利使用者設計實驗,例如:APC螢光是由633nm雷射激發,其偵測器編號D,會收集660±20 nm的光波,因此APC可以用於本校的LSRII。這些相關訊息皆放在網站上[1]。另外,多種螢光抗體一起使用時,也需要注意光譜重疊的情形,如圖一,例如PE-Cy5與PerCP的放射光譜重疊部分太多 不宜一起使用,反之,PE-Cy5與PE-Cy7可以一起搭配使用。



二、抗體與螢光物質的搭配

確定好螢光染劑後,還須搭配正確的單株抗體,才能實驗成功,主要的搭配原則是:螢光亮的染劑,搭配表現量低的分子(單株抗體),而螢光暗的染劑,搭配表現量高的分子;另外,如果要偵測的分子位於細胞內,則螢光染劑選擇亮的實驗效果較好。目前常用較亮的螢光染劑是PE與APC,而FITC染劑雖沒有前二者來得亮,但不易與其它染劑有顏色上的干擾,因此也常運用於實驗上。



三、去除死細胞的干擾

對於比例低的(<10%)的陽性細胞(被螢光抗體染上的細胞),需要去除死細胞的干擾,所得比例才會精準,因為死細胞通常會與單株抗體做非特異性結合(如圖二A紅色圈選處),造成偽陽性的訊號,因此可以利用與死細胞結合的染劑,例如:PI或是7-AAD,先將死細胞圈選除外後,再分析螢光抗體陽性的細胞比例(如圖二B),數值才會正確;其中選擇7-AAD比選擇PI為佳,因為PI的放射光譜範圍廣,比較容易干擾到別的顏色,例如:PI會干擾PE的顏色,因此二者不能共用。


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