Enews63 桿狀病毒(Baculovirus)在生物科技及生物醫學上的應用
出自KMU e-News
高雄醫學大學 第63期 生命科學院專題
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桿狀病毒(Baculovirus)在生物科技及生物醫學上的應用
生物科技學系 李景欽助理教授
桿狀病毒(baculovirus)是一種桿狀、含有雙股DNA基因（基因體約80-200 kd），主要感染鱗翅目昆蟲，病毒感染寄主後，會大量表達多角體蛋白，在細胞核中包裹病毒顆粒形成明顯的包含體(occlusion body) 又稱核多角體 (polyhedral inclusion body)，因此這一類病毒又稱為核多角體病毒(Nucleopolyhedrovirus, NPV)。這些核多角體蛋白基因 (polh 及p10)皆為非必要的結構性基因，意即在細胞培養上不影響其感染與複製能力，同時具有很強的起動子(promoter)活性，用來生產的外源蛋白可以達到細胞蛋白總量的25%~50%，此外，桿狀病毒可以藉由胞外抽取的病毒DNA經過細胞的轉染(transfection)過程，就可以複製完成具感染力的病毒顆粒 (例如AcMNPV 病毒)，這個的特性增加基因體操作上的便利性，因此透過基因重組方式，大大提升桿狀病毒的應用價值。昆蟲桿狀病毒的應用領域包括生物農藥、蛋白質量產、疫苗開發、基因治療的應用等，在生物科技產業及生物醫學上均可以看到其發展潛力。以下就這些應用領域做一些簡介，希望可以提供讀者在研究上另一種思考方向。
1. 生物農藥的開發：
桿狀病毒是昆蟲的病原體，長期以來被當作是一個有效的蟲害防治的微生物。由於並不會在人類細胞中造成任何病原性，這類核多角體病毒已被世界各國認可是一個安全性的微生物製劑。但是它致死的速度太慢，一般需要5天以上，昆蟲還是會繼續啃食作物，另外，病毒專一性太高，無法作為廣效性的生物防治劑，這些是其應用的瓶頸。目前利用基因重組技術，可以將對昆蟲有專一性的酵素、激素或毒素等基因插入桿狀病毒基因體中，藉此達到改變病毒的殺蟲範圍及促進殺蟲效果，例如?類毒素、蘇力菌素、蠍子毒素等。
2. 蛋白質量產的應用：
桿狀病毒表現載體系統(Baculovirus Expression Vector System; BEVS)從1980年初期由Smith & Summers (1983)建立以來，已被廣泛應用於外源蛋白的生產上，目前最常被用的病毒為加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)及家蠶核多角體病毒(BmMNPV)。相較於大腸桿菌及酵母菌蛋白質表達系統，此系統具備幾項優點：(1).昆蟲細胞屬於真核細胞，對蛋白質有較適當的修飾作用; (2).細胞可以在無動物源物質(例如胎牛血清)培養基培養，這使得蛋白質易於純化，尤其生產分泌性蛋白質（例如IgG），另外對於生產醫療級蛋白質（例如紅血球生成素;EPO）或膠原蛋白，也可以降低污染，提高其使用的安全性; (3).昆蟲細胞同樣可以藉由發酵槽的懸浮性培養進行量產，甚至於已經可以藉由感染蟲體（例如家蠶）來達到降低成本的目的。然而，此系統仍有其缺點，外源蛋白質通常是藉由病毒晚期極強的起動子(polh) 表達，此時期細胞已開始裂解並釋放蛋白脢，這使得蛋白質受到裂解及可能發生不當的蛋白質折疊，這些都影響蛋白質表現的產量與品質，因此如何兼顧產量及品質一直是這個系統要改良的目標。過去有研究學者提出以病毒早期基因起動子(如ie1)來表達外源蛋白質，結果生產的蛋白質品質提升了，但是產量仍嫌低。另外也有研究學者以病毒持續性感染特性或突變病毒基因體來達到的非胞裂性的桿狀病毒表達系統，同樣以晚期極強的起動子(polh) 表達蛋白，由於細胞不會發生裂解，使得蛋白質的回收量及品質大為提高。此系統在表現醣蛋白上也有一些瓶頸，就是昆蟲細胞的醣基化作用與哺乳類細胞不盡相同，近年來，已有很多研究學者利用基因轉殖方式致力於改造昆蟲細胞中的醣基化能力（例如轉殖哺乳類glycosyltransferase基因），相信將來可以克服這個問題。
桿狀病毒另一特性是其基因體可以容納較大的外源DNA片段(約38 kb)，也就是說可以將多個基因插入桿狀病毒基因體中，同時表達數個不同的基因產物，這對於複雜的組合型蛋白質的生產是相當有用，也是大腸桿菌或酵母菌系統無法做到的。
3. 疫苗開發：
疫苗的開發上最重要的考量是安全性、有效性及低成本製備，尤其針對高致病性的病毒如SARS，或難以透過細胞培養的病毒如C型肝炎病毒(HCV)，基本上都難以取得去活性或減毒性的病毒顆粒，而利用桿狀病毒/昆蟲細胞系統表達HCV結構蛋白(core, E1, E2)，最後形成所謂類病毒顆粒(virus-like particles; VLPs)，從實驗證明，這些類病毒顆粒保有病毒原本的空間結構，在實驗動物上，證實可以誘發高效價的中和抗體。同樣的，在其他病毒如SARS及H5N1也都可以得到類似的結果。另外，由於昆蟲細胞可以用無動物源物質(例如胎牛血清)培養基培養，相對降低不可預期的免疫反應。目前已有生技公司藉此系統投入疫苗的開發上。
4. 基因治療應用之潛力
由於這桿狀病毒對寄主具有專一性，只會感染昆蟲等無脊椎動物，近年來發現這一類病毒可以進入哺乳類細胞，但病毒基因體並不會複製，目前文獻發表約50種哺乳類細胞可被桿狀病毒感染，而且可以進到細胞核進行外源基因的表現。在基因療法的應用上，相較於哺乳類病毒（如線病毒及反轉錄病毒）其安全性相對來的高，目前在肝細胞、胰臟細胞及神經細胞等的研究上均有不錯的結果，最近研究更發現桿狀病毒也可以進入幹細胞進行基因的表現。就基因治療上，提高桿狀病毒進入哺乳類細胞的效率一直是研究的重點，目前透過基因重組方式將水泡性口炎病毒 (vesicular stomatitis virus (VSV)) G蛋白表達在病毒外鞘膜上，結果發現可以增加病毒轉殖效率，亦有研究學者嘗試將病毒鞘蛋白gp64與抗體結合，藉由細胞表面抗原的特異性，增加基因治療的專一性，因此被視為相當具有發展潛力的基因轉殖工具。
結語：農藥的大量使用一直人類健康及環境污染潛在的危機，減少農藥的使用最有效的方法就是利用微生物病原體如桿狀病毒來殺死昆蟲，雖然經過基因重組改造過的桿狀病毒是否會造成另一個生態環境問題，仍有待更精細的分子生物學來檢測，但開發病毒殺蟲劑已是生物農藥發展的重要趨勢。由於桿狀病毒是昆蟲的致病因子，並不會造成人類的疾病，除了早期生物農藥的開發受到重視，一直以來並沒有受到太多病毒學家的青睞，大部分的學者還是對引起人類疾病的病毒有興趣（如EBV, HIV, HCV 等等），而且也覺得是迫切需要的，但從桿狀病毒1980年代的蛋白質表系統到1990年代轉殖哺乳類細胞的發現，以至於疫苗的開發，在在顯示桿狀病毒在生物科技的發展與醫學應用上有其創新發展的潛力，甚至於可以預防或治療人類病毒所引起的疾病。桿狀病毒相關產品及服務市場有快數增加的趨勢，以2000年預估其市場值約30~80百萬美元，年成長率約10%，所以就生技產業上，是值得投入開發的領域。
