Enews200 光學技術在生物醫學影像之應用

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高雄醫學大學e快報第200期　研究資源整合發展中心專題

光學技術在生物醫學影像之應用

研究資源整合中心張偉嶠組長

俗話說：「百聞不如一見」。縱然是舌燦蓮花的形容與描述，也遠遠不及具體形像的真實呈現。在生物醫學研究也是如此，十多年前，筆者就讀博士班時，第一次利用離子染劑及高解析螢光顯微鏡，追蹤細胞內離子瞬間波動，透過影像所呈現的微觀生命舞動，至今仍然印象深刻。顯微鏡的發明滿足科學家們「眼見為憑」的好奇天性，讓人類有能力洞悉細胞、細菌、病毒甚至奈米世界。光路設計的日漸成熟、影像敏感度的提高、再搭配上多采多姿的分子(螢光)探針後，光學影像已經成為生醫研究的重要手段。本文將對「共軛焦（Confocal）顯微鏡」、「TIRF 全內反射螢光顯微鏡」、「FRET能量共振轉移技術」、「即時離子影像呈現技術（Real Time Ion imagine）」..等技術做簡單的介紹。

共軛焦（Confocal）顯微鏡: 傳統螢光顯微鏡焦距面較廣，景深也較深，所以螢光會同時發散而進入視野，形成光暈後干擾細部影像的清晰度。為了克服這個問題，顯微鏡在擷取影像時，發展出Pinhole（針孔）來過濾非焦距面的光線，以產生較清晰的螢光影像，這便是共軛焦顯微鏡的基本原理 (Fig 1)。Pinhole設計除了能夠清晰擷取共軛焦平面的影像之外，也能對影像做光切面擷取，累積連續不同深度平面所得影像後，即可建構出立體3D影像。

Fig. 1

TIRF 全內反射螢光顯微鏡: TIRF 的全名為：Total Internal Reflection Fluorescence。利用光學之全內反射原理: 調整入射角度之雷射光源，配合高孔徑值 (high NA) 之物鏡，當雷射光由物鏡入射至樣本，其入射角度(incident angle)大於臨界角度(critical angle)時，即可讓玻片與為水溶液之交界面發生全內反射現象 (Fig 2A)。利用光學全內反射現象使光源不至於穿透交界面而激發整體樣本 (受激發範圍只距蓋玻片表面厚度不到200 nm)。當待測分子分布於細胞膜時(如:離子通道或受體; Fig 2B)，這種技術可以大幅提高影像Z 軸向清晰度。因此，TIRF技術最適用於觀察細胞膜上所發生的生理反應。

Fig 2A 全內反射之光路

(螢光顯微鏡)

Fig. 2B. Re-distribution of STIM1 in HEK293 cells

(TIRF; data from張偉嶠實驗室)

FRET能量共振轉移技術(Fluorescence Resonance Energy Transfer): FRET是指兩個螢光發色基團在足夠靠近時，當供體分子(donor)吸收一定頻率的光子後被激發到更高的電子能態，在該電子回到基態前，通過偶極子相互作用(dipole-dipole interaction)，將能量轉移向鄰近的受體分子(acceptor) 的情形（發生能量共振轉移）。FRET是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將donor激發態能量轉移到acceptor激發態的過程，使donor螢光強度降低，若acceptor亦為發光基團時，則可以發散出更強於本身的螢光強度；因此，以顯微鏡為媒介，利用螢光共振能量轉移的技術，可以量測分子內或是兩分子間的距離，進而了解分子間的摺疊或交互作用。FRET技術已經廣泛地應用於核酸檢測、蛋白質結構…。

即時離子影像呈現技術（Real Time Ion imagine）:高解析螢光顯微鏡搭配快速CCD及適當離子螢光染劑後，細胞內離子的波動變可以清楚地被追蹤。舉鈣離子為例:細胞內鈣離子與螢光染劑Fura-2結合時，其激發波長為340 nm，較游離型Fura-2 的激發波長 (380 nm)為短。因此，透過測量兩個激發波長的螢光強度的比例，利用Grynkiewicz公式即可計算出細胞內游離鈣離子的含量。當然，經由改變不同離子螢光染劑，該技術可以應於於K＋, Na＋, Cl＿ ..等離子的偵測。